Ученые из Аризоны (США) придумали способ, позволяющий избирательно детектировать ДНК, содержащуюся в пробе в зептомолярных количествах. Необходимое для детектирования устройство состоит из трех основных частей. Во-первых, это молекулярный наномотор F1-АТФаза – компонент сложного ферментативного комплекса, отвечающего в организме за синтез АТФ. Эти молекулы связаны с авидином и прикреплены к подложке, покрытой Ni-NTA, при помощи шестигистинового тэга. Вторым важным компонентом системы являются золотые наночастицы, к которым также присоединен авидин. Наконец, третья необходимая составляющая – это молекула ДНК, на обоих концах которой имеется по молекуле биотина. Биотин способен прочно связываться с авидином – таким образом, при наличии всех трех компонентов в системе собираются наноустройства, изображенные на рисунке 1. А затем начинается самое интересное: если к готовой, полностью собранной системе добавить Mg2+ и AТФ, ротор компонента F1-АТФазы начнет вращаться, вращая и золотую наночастицу, прочно прикрепленную к наномотору при помощи ДНК! Результат в виде мерцания можно наблюдать в микроскоп, отличая таким образом целевое связывание от фона, вызванного неспецифичным связыванием частиц золота с подложкой. Этапы сборки наноустройства представлены на рисунке 2.
При нанесении молекул F1-АТФазы на подложку исследователи подобрали концентрацию молекул так, чтобы они располагались друг от друга на достаточном расстоянии: чтобы одна молекула ДНК не могла связаться обоими концами с двумя соседними молекулами F1-АТФазы, и чтобы собранные устройства не мешали друг другу во время вращения наночастиц золота (рисунок 3).
Понятно, что описанные наноустройства будут работать только в том случае, если в системе имеется биотинилированная с двух концов ДНК, способная связать F1-АТФазу и золотую частицу в единое целое. Одна дибиотинилированная ДНК соответствует одной молекуле определяемой ДНК. Чтобы этого добиться, необходимо изготовить два олигонуклеотидных зонда, один из которых связан с биотином со стороны 3’-конца, другой – с 5’-конца. Эти зонды комплементарны определяемому фрагменту ДНК и вместе полностью покрывают его. После добавления зондов к образцу смесь нагревают, чтобы разрушить двуцепочечные структуры ДНК, а затем охлаждают, чтобы двойные спирали вновь сформировались, но теперь уже между ДНК-мишенью и зондами. Затем к смеси добавляют ДНК-лигазу – фермент, сшивающий фрагменты ДНК в местах разрывов двуцепочечной ДНК. Если последовательность ДНК полностью комплементарна двум зондам (ситуация, изображенная на рисунке 4A), то в результате работы лигазы образуется двуцепочечная ДНК без разрывов, и последующее добавление ДНК-полимеразы не приводит ни к каким изменениям.
Ситуация меняется, если зонды не полностью комплементарны целевой ДНК (рисунок 4B). В этом случае лигаза не срабатывает, и после добавления ДНК-полимеразы, которая обладает также экзонуклеазной активностью, полимераза синтезирует новую цепь ДНК, начиная с места разрыва и разрушая при этом один из зондов. В результате формируется ДНК, биотинилированная лишь с одной стороны – и, разумеется, сигнал в виде крутящихся золотых наночастиц от такой ДНК получен не будет.
Таким образом, метод позволяет распознавать точечные замены в молекулах ДНК, что часто как раз и требуется при анализе генетических заболеваний, обнаружении патогенов и онкогенов. Работа «Single-molecule detection of DNA via sequence-specific links between F1-ATPase motors and gold nanorod sensors» опубликована в Lab on a Chip. А авторы тем временем работают над созданием аналогичной системы, но уже для детектирования белков.
Также можно ознакомиться с видео-роликом (3.37 Мб), в котором весело мигают красные точки.
Рисунок 1. Схема наноустройства для детектирования единичных молекул ДНК.
Рисунок 2. Этапы сборки: к молекулам F1-АТФазы, нанесенным на подложку, присоединяются молекулы ДНК благодаря взаимодействию авидина и биотина (i); золотые наночастицы связываются с другим концом ДНК (ii); при добавлении ионов магния и АТФ F1-АТФаза начинает вращать частицу золота (iii).
Рисунок 3. Молекулы F1-АТФазы на подложке (АСМ).
Рисунок 4. Схема синтеза молекул ДНК, содержащих по молекуле биотина с каждого конца, в случае, когда матрица полностью комплементарна зондам (A). В случае некомплементарной ДНК такие же манипуляции приводят к образованию молекулы ДНК, содержащей биотин лишь на одном конце (B).
Рисунок 5. А вот и золотые наночастицы, мерцание которых можно наблюдать в микроскоп в случае успешной сборки нанодетектора (ПЭМ).
|
